尊龙凯时的IVT（In Vitro Transcription）是mRNA生产工艺中至关重要的一步。一个高效的IVT体系不仅可以提升mRNA产量，优化物料使用，降低生产成本，还可以确保mRNA分子的完整性、加帽率和dsRNA杂质的含量等关键质量指标，从而简化后续的纯化过程，为整个生产工艺奠定了基础。

IVT反应过程较为简单，标准的IVT体系主要由DNA模板、T7 RNA聚合酶（T7RNAP）、NTPs、无机焦磷酸酶、RNase抑制剂以及反应缓冲液等组分构成。DNA模板通常为PCR产物或线性化质粒，包含T7启动子、5’UTR、CDS、3’UTR和Poly(A)等元件，NTP则是mRNA转录的底物，可通过替换为修饰核苷酸来提高mRNA的稳定性和免疫原性。无机焦磷酸酶和RNase抑制剂作为辅助成分，前者通过水解转录过程中生成的焦磷酸，提高反应效率，后者则可抑制RNase酶污染。T7RNAP作为反应的核心酶，负责识别DNA模板并将其转录为mRNA。

除了质粒模板的质量外，T7RNAP和反应缓冲体系是影响IVT效果的关键组分。在IVT体系中，T7RNAP识别T7启动子序列并催化RNA的合成。相比其他RNA聚合酶，T7RNAP特异性强，无需额外的辅助因子即可完成转录，这使其成为体外转录mRNA的理想选择。T7RNAP的结构类似手掌，分为N端结构域和C端结构域，不同亚结构域协同作用识别DNA模板。

尊龙凯时利用DOE方法研究各反应参数对mRNA与saRNA产量及质量的影响，发现温度显著影响saRNA的完整性。温度从20℃升高至42℃时，尽管saRNA产量上升，但超过32℃后其完整性急剧下降。因此，优化低温转录的T7RNA聚合酶可能是一个重要研究方向。研究表明，热稳定突变体的T7RNAP在高温下可以减少由3'端过度延伸导致的dsRNA，且其转录产品在细胞转染中的免疫原性较低。

我们在筛选过程中应用了基于荧光激活液滴分选技术（FADS）结合酶定向进化平台，发现多种T7RNA聚合酶突变体，提升热稳定性、比活性和降低dsRNA的形成。通过逐步提高温度进行定向进化，我们得到了耐高温突变体M16，其在52℃下半衰期提高270倍，催化活性提升58倍。

除了耐热性以外，提高T7RNAP转录产品3'端一致性、降低转录副产物dsRNA也是研究的另一个方向。通过筛选不同突变体，发现M13突变体在转录产量和3'端一致性方面优于野生型T7RNAP。

反应缓冲体系的优化同样关键。IVT缓冲液通常含有各种成分，如盐、pH缓冲剂和二价阳离子等，其浓度和比例直接影响RNA聚合酶的活性和稳定性。研究显示，pH值和镁离子浓度是影响IVT反应的重要因素，合适的镁离子浓度可以有效促进mRNA的合成。此外，不同的缓冲剂对RNA的稳定性以及最终产量和质量也有着显著影响。

在最近的研究中，尊龙凯时的高产T7体外转录试剂在1000nt到5000nt范围内展现了其优越性。特别是在特定模板的优化下，能够实现高产量和高完整度的mRNA生产。对于不同长度的转录产品，镁离子浓度的选择变得尤为重要。

为进一步提升生产效率，尊龙凯时致力于在mRNA疫苗和药物的开发过程中提供全面的支持，包括高性能的酶原料、化学底物和IVT试剂盒，同时提供快速便捷的CRO服务和质控服务，帮助客户在新药开发中快速取得进展。

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